微生物发酵法生产磷脂酰丝氨酸的菌株筛选：高产酵母的代谢通路改造

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）是一种具有调节大脑功能、改善认知等生理活性的磷脂类物质，传统提取法（从动物脑组织、大豆中提取）存在原料受限、纯度低、成本高等问题。微生物发酵法以酵母为宿主菌合成磷脂酰丝氨酸，具有原料廉价、可规模化、产物纯度高的优势，其核心在于高产菌株的筛选与代谢通路的定向改造。以下从菌株筛选原则、酵母代谢通路基础、改造策略及关键技术展开分析。

一、高产磷脂酰丝氨酸酵母菌株的筛选原则与初始菌株选择

1. 筛选核心原则

酵母菌株需满足自身磷脂合成能力强、遗传操作可控、发酵耐受性好三大核心条件，具体筛选指标包括：

基础磷脂酰丝氨酸产量：野生型酵母（如酿酒酵母）自身可合成磷脂酰丝氨酸，筛选天然的产量＞5mg/L的菌株作为出发菌株；

生长特性：在廉价培养基（如葡萄糖、玉米浆培养基）中生长速率快，耐受高渗透压、高溶氧环境，适合高密度发酵；

遗传稳定性：易于进行质粒转化或基因组编辑，且改造后菌株的遗传性状稳定，不易发生回复突变；

副产物少：发酵过程中不产生大量有机酸、乙醇等抑制性副产物，避免对磷脂合成的反馈抑制。

2. 常用初始菌株

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：食品安全级菌株（GRAS），磷脂合成通路研究最透彻，遗传操作工具成熟，是生产食品级、医药级磷脂酰丝氨酸的首选宿主；

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）：油脂和磷脂合成能力强，可利用多种碳源（如油脂、甘油），适合工业化高密度发酵；

毕赤酵母（Pichia pastoris）：表达外源基因效率高，可分泌表达磷脂合成相关酶，减少胞内产物降解风险。

二、酵母合成磷脂酰丝氨酸的天然代谢通路基础

酵母胞内磷脂酰丝氨酸的合成主要依赖磷脂酰胆碱（PC）-磷脂酰乙醇胺（PE）-PS转化通路和CDP-二酰甘油（CDP-DAG）直接合成通路，两条通路协同调控磷脂酰丝氨酸的积累：

CDP-DAG 直接合成通路（核心通路）该通路是酵母合成磷脂酰丝氨酸的主要途径，反应步骤如下：

糖酵解产物磷酸二羟丙酮生成磷脂酸（PA），PA 在磷脂酸磷酸酶作用下生成二酰甘油（DAG）；

DAG与CTP在CDP-DAG合成酶（Cds1p） 催化下生成CDP-DAG；

CDP-DAG与丝氨酸在磷脂酰丝氨酸合成酶（Pss1p） 催化下生成磷脂酰丝氨酸，该酶是此通路的限速酶，直接决定 PS 的合成速率。

PE-PS转化通路（辅助通路）磷脂酰乙醇胺（PE）在磷脂酰丝氨酸脱羧酶（Psd1p/Psd2p） 作用下可反向生成磷脂酰丝氨酸（酵母中该反应可逆），但反应效率较低，需通过改造增强该通路的通量。

关键调控节点

限速酶Pss1p：受胞内磷脂酰丝氨酸浓度的反馈抑制，且其编码基因PSS1的表达量较低，是通路改造的核心靶点；

辅因子供应：丝氨酸是合成磷脂酰丝氨酸的底物，胞内丝氨酸浓度不足会限制它的合成；CTP是CDP-DAG合成的能量底物，需保障其充足供应；

磷脂转运：合成的磷脂酰丝氨酸主要积累在细胞膜上，需通过磷脂转运蛋白（如Mss4p）将它转运至胞内储存，减少分泌流失。

三、高产酵母菌株的代谢通路改造策略

针对天然通路的限速步骤、底物供应、反馈抑制等瓶颈，采用基因工程编辑技术（如CRISPR-Cas9、同源重组）进行定向改造，核心策略包括以下4个方面：

1. 强化核心合成通路，解除限速酶抑制

过表达限速酶编码基因将强启动子（如酿酒酵母的TEF1启动子、GPD启动子）与PSS1基因融合，整合至酵母基因组，提升磷脂酰丝氨酸合成酶的表达量，直接提高磷脂酰丝氨酸合成速率。研究表明，过表达PSS1基因可使酿酒酵母的磷脂酰丝氨酸产量提升2~3倍。同时，过表达CDS1基因（编码CDP-DAG合成酶），增加前体物CDP-DAG的供应，缓解底物限制。

解除限速酶的反馈抑制通过定点突变改造Pss1p的活性中心，降低其对产物磷脂酰丝氨酸的亲和力，消除反馈抑制，例如，突变Pss1p的第156位丙氨酸为甘氨酸，可使酶活性提升40%，且不再受其浓度的抑制。

2. 优化底物供应通路，保障前体与辅因子充足

强化丝氨酸合成通路丝氨酸是磷脂酰丝氨酸的直接底物，酵母中丝氨酸由3-磷酸甘油酸经3-磷酸甘油酸脱氢酶（Ser3p） 催化合成。过表达SER3基因，同时敲除丝氨酸降解基因 SHM1（编码丝氨酸羟甲基转移酶），可使胞内丝氨酸浓度提升50%以上，显著促进磷脂酰丝氨酸合成。此外，在发酵培养基中添加廉价的L-丝氨酸（或其前体物甘氨酸），可进一步提升胞内底物浓度。

保障CTP辅因子供应CTP由UTP在CTP合成酶（Ura7p） 催化下生成，过表达URA7基因可增加CTP的合成量，为CDP-DAG的生成提供能量，避免因能量不足导致的通路停滞。

3. 阻断竞争通路，减少碳流流失

酵母胞内的磷脂合成存在多条竞争通路（如合成PC、PE、磷脂酰肌醇等），这些通路会消耗共同前体物CDP-DAG，降低磷脂酰丝氨酸的碳流分配比例。

敲除竞争通路关键基因：敲除CHO1基因（编码磷脂酰乙醇胺甲基转移酶，催化PE合成PC），阻断PC合成通路，使碳流更多流向磷脂酰丝氨酸合成；

弱化磷脂降解通路：敲除PLC1基因（编码磷脂酶C，降解磷脂生成DAG），减少磷脂酰丝氨酸的降解，提升产物积累量。

4. 增强产物转运与储存，减少胞外分泌

合成的磷脂酰丝氨酸易结合在细胞膜上，过量积累会影响细胞膜的通透性和细胞生长，需通过改造磷脂转运通路实现它的胞内储存：

过表达磷脂转运蛋白基因：过表达MSS4基因（编码磷脂酰肌醇激酶，参与磷脂转运），促进细胞膜上的磷脂酰丝氨酸转运至胞内脂滴中储存；

构建工程化脂滴：过表达脂滴形成相关基因（如ARE1、DGA1），增加胞内脂滴数量和体积，为磷脂酰丝氨酸提供储存位点，避免产物对细胞的毒性。

四、菌株改造的关键技术与筛选验证

1. 高效基因编辑技术

CRISPR-Cas9技术：精准敲除或插入目标基因，具有操作简便、效率高的优势，适合多基因的协同改造；

同源重组技术：将外源基因（如强启动子驱动的PSS1）整合至酵母基因组的特定位点（如非必需基因位点），保障基因表达的稳定性；

质粒表达系统：构建多拷贝表达质粒，实现多个通路基因的同时过表达，适合快速筛选最优基因组合。

2. 高通量筛选与验证方法

初筛：采用薄层层析（TLC） 快速检测发酵液中的磷脂酰丝氨酸含量，筛选出其产量显著提升的突变菌株；

复筛：通过高效液相色谱（HPLC） 精准定量磷脂酰丝氨酸的产量，同时检测菌株的生长速率、底物利用率等指标，筛选综合性能最优的菌株；

稳定性验证：将目标菌株连续传代10代以上，检测每代的磷脂酰丝氨酸产量，筛选遗传性状稳定的菌株。

五、 发酵工艺优化与工业化应用潜力

代谢通路改造后的高产菌株需结合发酵工艺优化，进一步提升磷脂酰丝氨酸的产量：

培养基优化：优化碳源（葡萄糖/甘油比例）、氮源（酵母膏/尿素）、无机盐浓度，添加 L-丝氨酸、维生素B族等促进因子；

发酵参数调控：控制发酵温度（28~30℃）、pH（5.5~6.0）、溶氧（DO＞30%），采用分批补料发酵策略，避免葡萄糖过量导致的乙醇积累；

诱导表达调控：使用诱导型启动子（如半乳糖诱导的GAL1启动子）控制关键基因的表达，在菌株生长至对数期后诱导表达，减少基因过表达对细胞生长的负担。

目前，经代谢通路改造的酿酒酵母菌株，在实验室分批补料发酵条件下，磷脂酰丝氨酸产量可达500~800mg/L，部分工程菌株产量突破1g/L，具备工业化放大潜力。

微生物发酵法生产磷脂酰丝氨酸的核心是通过菌株筛选+代谢通路改造，实现酵母胞内磷脂酰丝氨酸合成的“开源、节流、稳储”。未来的研究方向将聚焦于：

挖掘新的高产酵母菌株（如极端环境酵母），拓展宿主菌的选择范围；

结合合成生物学技术，构建人工合成的磷脂酰丝氨酸合成通路，进一步提升碳流分配效率；

开发高效的产物分离提取工艺，降低下游纯化成本，推动发酵法磷脂酰丝氨酸的产业化应用。